Kā izvairīties no oksidēšanās elektroforēzes laikā?

Visaptverošas stratēģijas, lai izvairītos no oksidēšanās elektroforēzes laikā

I. Elektroforētiskās oksidācijas pārskats

Elektroforēzei kā svarīgai atdalīšanas un analīzes tehnikai ir plašs pielietojums bioķīmijā, molekulārajā bioloģijā un materiālu zinātnē. Tomēr oksidēšanās elektroforēzes laikā bieži ietekmē eksperimentālo rezultātu kvalitāti un reproducējamību. Oksidācijas reakcijas var izraisīt parauga noārdīšanos, proteīnu modifikācijas, nukleīnskābju pārrāvumus un neskaidras elektroforētiskās joslas, kas nopietni ietekmē analītisko rezultātu precizitāti.

Elektroforētiskā oksidācija galvenokārt rodas no šādiem avotiem: 1) reaktīvās skābekļa sugas, kas rodas ūdens elektrolīzes laikā; 2) brīvie radikāļi, kas rodas elektrodu reakciju rezultātā; 3) vidē izšķīdušais skābeklis; un 4) noteiktu bufera komponentu automātiska -oksidācija. Šie oksidējošie faktori reaģē ar jutīgām grupām paraugā (piemēram, tiola grupām olbaltumvielās un bāzēs nukleīnskābēs), mainot parauga sākotnējo stāvokli.

II. Bufersistēmu optimizācija

Bufersistēmas ir elektroforēzes sistēmas galvenā sastāvdaļa, un to izvēle un sagatavošana tieši ietekmē oksidācijas pakāpi. Tris-glicīna bufersistēma parasti tiek izmantota SDS-PAGE, taču ilgstošas ​​elektroforēzes laikā tā var radīt ievērojamas pH izmaiņas un oksidācijas produktus. Var apsvērt šādus uzlabojumus:

1. Izmantojiet antioksidantu buferšķīdumu: pievienojot buferšķīdumam reducētāju, piemēram, DTT (ditiotreitolu) vai -merkaptoetanolu (galīgā koncentrācija 1-5 mM), var efektīvi aizsargāt proteīnu brīvās sulfhidrilgrupas no oksidēšanās. Nukleīnskābju elektroforēzei EDTA (1-5 mM) var pievienot, lai helātus metālu jonus, samazinot metālu katalizētās oksidācijas reakcijas.

2. Izvēlieties stabilāku bufersistēmu: Bis-Tris vai HEPES buferi ir stabilāki nekā Tris, tiem ir mazāka pH novirze un tie rada mazāk reaktīvo skābekļa sugu. Izoelektriskās fokusēšanas elektroforēzei, izmantojot amfoteros elektrolītus, jāņem vērā to oksidējamība un var pievienot atbilstošus antioksidantus.

3. Sagatavojiet buferus svaigus: izvairieties no pārāk ilgi glabātu buferu lietošanas, jo īpaši tos, kas satur viegli oksidējamus komponentus (piemēram, SDS). Ieteicams sagatavot un lietot nekavējoties vai sadalīt alikvotā veidā un uzglabāt -20 grādu temperatūrā.

4. Kontroles bufera pH: uzturiet buferšķīdumu piemērotā pH diapazonā (pH 6-9). Pārāk augsts vai zems pH līmenis var paātrināt noteiktas oksidācijas reakcijas. Precīzai kalibrēšanai izmantojiet pH mērītāju, izvairoties no paļaušanās tikai uz pH testa strēmelēm.

III. Precīza elektroforēzes apstākļu kontrole

Elektroforēzes parametru optimizēšana ir ļoti svarīga oksidācijas samazināšanai, un tai ir nepieciešama kontrole pār vairākiem aspektiem, tostarp spriegumu, strāvu un temperatūru:

1. Sprieguma un strāvas kontrole: pastāvīga sprieguma režīma izmantošana pastāvīgas strāvas režīma vietā samazina elektrolītiskās reakcijas. Parasti olbaltumvielu elektroforēzes spriegumu kontrolē pie 100-150 V, bet nukleīnskābju elektroforēzi pie 50-100 V. Augsts spriegums rada vairāk elektrolītisko produktu un siltuma, pastiprinot oksidāciju.

2. Temperatūras pārvaldība: džoula karsēšana, kas rodas elektroforēzes laikā, paātrina oksidācijas reakcijas. Var izmantot cirkulācijas ūdens dzesēšanas sistēmu vai elektroforēzes aparāta novietošanu 4 grādu vidē. Saliekamiem gēliem ir labāka siltuma izkliede un stabilāka temperatūra nekā mājās gatavotiem gēliem.

3. Elektroforēzes laika optimizācija: samaziniet elektroforēzes laiku, vienlaikus nodrošinot atdalīšanas efektivitāti. Laiku var noteikt, veicot iepriekšējus eksperimentus, lai izvairītos no nevajadzīgiem gariem elektroforēzes periodiem.

4. Elektrodu aizsardzība: Platīna elektrodi ir stabilāki nekā oglekļa vai nerūsējošā tērauda elektrodi, samazinot elektrodu reakcijas blakusproduktus. Regulāri tīriet elektrodus, lai novērstu oksidēšanās produktu uzkrāšanos. IV. Paraugu apstrāde un aizsardzības pasākumi

Paraugu apstrāde un aizsardzība ir pirmā aizsardzības līnija pret oksidāciju:

1. Parauga sagatavošana: Pievienojiet pietiekami daudz reducētāja (piemēram, 5-10 mM DTT vai 5% -merkaptoetanola) līzes buferšķīdumam, lai pilnībā samazinātu proteīna disulfīda saites. Īpaši jutīgiem paraugiem apstrādi var veikt slāpekļa aizsardzībā.

2. Paraugu konservēšana: pēc alikvotu sadalīšanas uzglabājiet -80 grādu temperatūrā, izvairoties no atkārtotiem sasaldēšanas-atkausēšanas cikliem. Glicerīna pievienošana (galīgā koncentrācija 10-20%) var samazināt sasalšanas-atkausēšanas bojājumus un oksidēšanos.

3. Paraugu iekraušanas paņēmieni: Ievietojiet paraugus pēc iespējas ātrāk, lai samazinātu ekspozīcijas laiku elektroforēzes tvertnē. Lai izolētu paraugu no gaisa, var izmantot pārklājošo slāni (piemēram, minerāleļļu).

4. Īpaša aizsardzība: paraugiem ar augstu oksidācijas pakāpi (piemēram, noteiktiem enzīmiem vai transkripcijas faktoriem) elektroforēzes buferšķīdumam var pievienot brīvo radikāļu uztvērējus, piemēram, askorbīnskābi (1-5 mM) vai tiourīnvielu (1-3 mM).

V. Vides un iekārtu optimizācija

1. Aizsardzība pret inertu gāzi: slāpekļa vai argona pievienošana elektroforēzes tvertnē, lai aizstātu gaisu, var ievērojami samazināt oksidāciju. Vienkārša metode ir pārklāt elektroforēzes bufera virsmu ar inertas gāzes slāni.

2. Gaismas-pārbaudes darbība: dažas oksidācijas reakcijas tiek fotokatalizētas; jāizvairās no tiešas spēcīgas gaismas iedarbības uz elektroforēzes aparātu. Aparāta iesaiņošanai var izmantot alumīnija foliju vai arī elektroforēzes tvertni var saglabāt necaurspīdīgu.

3. Aprīkojuma apkope: regulāri pārbaudiet elektroforēzes aparāta elektrodu un vadu savienojumus, lai nodrošinātu labu kontaktu un samazinātu neparastu elektrolīzi. Iztīriet elektroforēzes tvertni, lai noņemtu uzkrātos oksidācijas produktus.

4. Apstrāde pēc-elektroforēzes: oksidācijas novēršana ir ļoti svarīga arī pārvietošanas vai krāsošanas laikā. Pārneses buferšķīdumam var pievienot reducētāju, un krāsošanas laikā jāizvairās no ilgstošas ​​gaisa iedarbības.

VI. Speciālo elektroforēzes metožu oksidācijas novēršanas stratēģijas

1. Divdimensiju-elektroforēze: izoelektriskās fokusēšanas posmā ir ļoti iespējama oksidēšanās. Paraugam un pārklājošajam šķīdumam var pievienot tiourīnvielu (2M) un reducētāju. Fokusēšanas process jāveic slāpekļa aizsardzībā.

2. Ne-denaturējoša elektroforēze: lai saglabātu proteīnu dabisko stāvokli, ir nepieciešama spēcīga aizsardzība pret oksidāciju. Izvairieties no spēcīgiem oksidētājiem buferšķīdumā; var pievienot glicerīnu (10-20%), lai stabilizētu proteīna konformāciju.

3. RNS elektroforēze: RNS ir ļoti jutīga pret degradāciju un oksidēšanos. Visi šķīdumi jāsagatavo ar DEPC-attīrītu ūdeni. Izmantojiet īpašu elektroforēzes aparātu un stingri noņemiet RNāzi. Pievienojiet RNāzes inhibitorus buferšķīdumam.

4. Kapilārā elektroforēze: kapilāru mazā izmēra dēļ oksidācijas efekts ir nozīmīgāks. Pārklātos kapilārus var izmantot, lai samazinātu adsorbciju un oksidāciju. Buferšķīdumam jābūt stingri atgāzētam.

VII. Biežākās problēmas un risinājumi

1. Neskaidras vai asas olbaltumvielu joslas: tas var būt saistīts ar oksidāciju, kas izraisa olbaltumvielu agregāciju vai degradāciju. Pārbaudiet, vai reducētājs ir neefektīvs, vai buferšķīdums ir svaigs un vai elektroforēzes temperatūra nav pārāk augsta.

2. Neskaidras nukleīnskābju elektroforēzes joslas: tas var būt saistīts ar oksidācijas pārrāvumu. Pārliecinieties, ka tiek izmantots EDTA, bufera pH ir pareizs un elektroforēzes laiks nav pārāk garš.

3. Vājš Western blot signāls: oksidēšanās var izraisīt antigēna epitopu bojājumus. Optimizējiet parauga apstrādes un pārvietošanas apstākļus un pievienojiet pietiekami daudz reducētāja. 4. Nenormālas izoelektriskās fokusēšanas šķautnes: oksidēšanās izraisa amfoteriskā elektrolīta nestabilitāti. Pārbaudiet fokusēšanas laiku un spriegumu un apsveriet aizsardzību pret inertu gāzi.

Vispusīgi piemērojot iepriekš minētās stratēģijas, oksidāciju elektroforēzes laikā var efektīvi kontrolēt, tādējādi iegūstot ticamākus un reproducējamākus eksperimentālos rezultātus. Dažādām eksperimentālām sistēmām var būt nepieciešama mērķtiecīga optimizācija; ieteicams, veicot iepriekšējus eksperimentus, noteikt piemērotu antioksidācijas shēmu.